掃描電鏡樣品的干燥
樣品的制備中，干燥是最關鍵的步驟。干燥過程除引起樣品收縮之外，水的表面張力會使樣品表面形貌發生很大的變化，這對掃描電鏡的表面形貌觀察特別有害。在透射電鏡的樣品制備中用乙醇脫水，是為了包埋劑的滲透(因水不與包埋劑互溶，而乙醇則能互溶)。而在掃描電鏡的樣品制備中，脫水是用表面張力小的乙醇取代表面張力很大的水，從而使干燥過程對樣品表面產生的影響較少。然后就是如何設法使樣品表面不受或少受表面張力影響的條件下除去乙醇，這就是干燥。目前常用的干燥方法主要有空氣干燥法、臨界點干燥法、冰凍干燥法、真空干燥法和莰烯干燥法等。 空氣干燥法： 空氣干燥法又稱自然干燥法，就是將經過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發干燥。此法的最大優點是簡單易行和節省時間，它的致命缺點是在干燥過程中，組織會因脫水劑揮發時表面張力的作用而產生收縮變形。因此，此種方法一般只適用于外殼(表面)較為堅硬的樣品。 在采用空氣干燥時，為了減少樣品的收縮變形，除使用易揮發和表面張力小的脫水劑如乙醇、丙酮等外，還應使樣品得到充分固定，特別是須經四氧化鋨固定效果才較好。因為它會使組織變得較為堅硬，使收縮變形減少。 然而，空氣干燥引起的收縮并非完全不利，有時可以通過收縮使細胞之間相互剝離，從而能清楚地觀察到一個個單獨存在的細胞及其表面結構。此外，還可通過細胞成份在干燥時的收縮，觀察到細胞內的線粒體、細胞核等成份的存在。但這種機會很少，而且因收縮帶來的不利是主要的，所以，目前很少采用。 臨界點干燥法： 臨界點干燥法是一種消除了物相界面(液相／氣相)，也就是消除了表面張力來源的干燥方法。這種方法由于沒有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷，此法所用的儀器結構不甚復雜，操作較為方便，所用的時間也不算長，一般約2h左右即可完成，所以，是最為常用的方法。 物質的臨界點是1822年由Charles cagridde La Tour發現的。他將不同的液體分別裝進玻璃試管并密封起來，然后一邊轉動一邊加熱，這時，他發現隨著溫度的升高，試管內的液相和氣相之間的彎月面開始變得模糊起來，只有在試管冷卻之后，彎月面才又重新出現。每種液體都存在某一溫度，在這一溫度時，液相的彎月面完全消失。 那么，彎月面的消失意味著什么呢?它意味著液相和氣相之間的界面沒有了，之所以出現這種現象，是因為在密封的容器里，液體受熱膨脹，而氣體本身被壓縮，最后在某一特定的溫度和壓力下，液體由于膨脹，氣體由于被壓縮而使兩者的密度相同，因而相互混合成一種均一的流體，原先存在它們之間的彎月面(即液面)就消失了，表面張力也自然消失了。因此，所謂臨界點，就是指使物質的氣態和液態兩相之間達到相同密度，成為均一流體狀態時的溫度和壓力的總稱。此時的溫度稱臨界溫度；此時的壓力稱臨界壓力。 不同的物質都有其特定的臨界點，一般用于掃描電鏡樣品臨界點干燥的置換劑的臨界溫度和壓力見表10-1。如果在臨介點進行干燥，由于表面張力消失就不會造成樣品表面的損傷。但進行臨界點干燥，需用專用的臨界點干燥器。具體處理步驟如下： 固定脫水 按透射電鏡常規制樣方法進行。 純丙酮置換乙醇 如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至100％后，用純丙酮置換15～20min。 中間液處理 即在用丙酮置換乙醇后,用醋酸異戊酯(乙酸異戊B8)處理15-80min(也可以過夜)置換丙酶。由于醋酸異戊酯與液態二氧化碳能互溶，使液態二氧化碳容易滲入樣品中。 裝樣： 將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。(注：在裝樣前，應先打開儀器電源，將溫度調節設定在0℃處預冷10～15min，以保證液態二氧化碳有足夠量進入樣品杯中)。注入液體二氧化碳 依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進氣閥在0～10℃下，向樣品杯注入液體二氧化碳。 漂洗： 當液體二氧化碳充至樣品杯容積的50％(通過刻度尺觀察，以液面超過樣品籠為度)時，關閉儀器進氣閥，靜置15～20min，讓醋酸異戊酯向液態二氧化碳中充分擴散，然后，打開儀器排氣流量計閥門和進氣閥門，讓其邊排氣邊充液10min左右，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態二氧化碳)再關閉排氣閥；繼續充入液體二氧化碳至樣品杯的80％左右，關閉進液閥，停止充液。 加溫置換： 將溫度調節設定在20℃處經15～20min后，由于溫度升高，杯內液體二氧化碳逐漸氣化，因此，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置換。 氣化： 將溫度旋鈕調至臨界溫度以上(35～40℃)，此時隨著溫度升高，樣品杯內的壓力也逐漸增加，達到二氧化碳的臨介點，界面也隨之消失。當壓力達到7134Pa時，經5min后，即可排氣。 排氣 在保持溫度不變的條件下(即不關電源)，打開流量計的排氣閥門，以1.0～1.51／min的速度排氣(速度慢些更好)。約經45～60min后，排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調節至室溫約5rain后，即可取出樣品裝臺鍍膜(若不能立即裝臺，應置于干燥器內保存)。 臨界點干燥的成敗如何；與每一步的操作有很大關系，因此，操作時應注意以下事項： 在樣品放進樣品杯前，樣品杯應預先冷卻至0～10℃，因為溫度過高，充入的液體二氧化碳會立即氣化膨脹，壓力增加，妨礙二氧化碳液體繼續進入樣品杯。 樣品不宜過濕，但也不能讓其表面干涸，應在半干半濕時送入樣品杯。因為過濕表明乙酸異戊脂太多會干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂，影響干燥效果。而過干又會因空氣干燥而造成樣品己變形，再進行臨介點干燥也沒有意義了。 一次加入的樣品不宜過多，以免帶進過多的中間液，使樣品干燥不完全，另外，樣品過多使二氧化碳量充入不足而達不到臨界點。 充入液體二氧化碳的量要足。因為充液量不足，達不到臨界值，起不到臨界點干燥作用，一般充液量應達樣品杯容積的2/3左右。 在加溫氣化時，實際操作溫度應超過臨界值，以保證達到充分的臨界狀態。 "開"、"閉"閥門時，動作要輕緩，盡量防止二氧化碳液對樣品產生突然沖擊而造成樣品損傷。因此，樣品籠的上下應墊上一層鏡頭紙或濾紙。排氣速度也應盡量緩慢，一般放氣時間應在．4Omin以上，有時也可以放氣過夜或過中午。 二氧化碳臨界點干燥法除用液體二氧化碳外，也有用固體二氧化碳(干冰)作干燥介質的。與液體二氧化碳比較，固體二氧化碳有以下優點: 有利于微小樣品的干燥，例如像玻璃片上的游離細胞，若用液體二氧化碳干燥，由于二氧化碳氣體急劇地噴入樣品杯內很可能使樣品被吹掉，而用固體二氧化碳干燥，則完全沒有這種危險。 不需要用鋼瓶，鋼瓶很重，搬運麻煩；用固體二氧化碳時，有適當大小的保溫瓶(如冰壺)就可以了，因此很方便。 能保證二氧化碳裝滿樣品室，即使用固體二氧化碳時，每次都能準確地放入足夠酌量，而不會像使用液體二氧化碳時由于鋼瓶中二氧化碳不足，充不進樣品杯內，使樣品干燥不完全而造成損傷。 夏天使用方便 在使用液體二氧化碳時，若室溫超過臨界溫度，液體二氧化碳難以從鋼瓶進入樣品室，而固體二氧化碳則不受室溫高低的影響，即無論多熱的天氣也能放進足夠量。 不污染樣品 使用液體時，往往由于鋼瓶內有鐵銹粉末充進樣品杯而污染樣品，而固體二氧化碳則無此種污染。 固體二氧化碳臨界點干燥法除使用專門裝置外，也可用任何一種液體臨界點干燥器，不過由于液體臨界點干燥器的樣品室較小，操作起來不大方便。固體二氧化碳臨界點干燥法的樣品處理{固定、脫水等)與液體二氧化碳臨界干燥法相同，所不同的是在于干燥時的具體操作。其操作步驟是：先將干冰用加熱器切成樣品杯容積大小的圓柱體(也可敲成碎塊或粉末)，放于樣品籠的頂部，蓋好樣品杯蓋，然后加熱到15℃，使干冰熔化成液體二氧化碳，這時干燥器內的壓力上升，再加熱到40C，使液體二氧化碳逐漸氣化，壓力繼續上升達到臨界值，幾分鐘后即可排氣(溫度不變)。當氣體全部排出，壓力回到零后，即取出樣品，裝臺鍍膜觀察。 冰凍干燥法： 冰凍干燥是將經冰凍的樣品置于高真空中通過升華，除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冰凍干燥的基礎是冰(或固態溶劑)從樣品中升華，也就是使水分從固態直接轉化為氣態，不經過中間的液態,不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用，因此，能較好地避免或減少了在干燥過程中對樣品的損傷。冰凍干燥方法有兩種，即含水樣品直接冰凍干燥和樣品脫水后從有機溶劑中冰凍干燥。 含水樣品直接冰凍干燥法: 此法相對于臨界點干燥有其明顯優點，即能直接使含水樣品冰凍干燥，不需要用有機溶劑脫水和置換，避免了無極性溶劑對樣品成份的抽提作用，因此，不會使樣品收縮和膜結構或表面物質產生穿蝕。如用此法干燥植物葉的樣品，葉面角質層能保持自然狀態，從而得到好的實驗樣品。 含水樣品冰凍干燥的步驟如下： 取材固定，按常規方法進行。 冰凍保護劑滲透 將樣品置于10％～20％的二甲基亞砜(DWSO)水溶液或15％～40％的甘油水溶液，或氯仿中浸泡數小時。 驟冷 將經保護劑處理過的樣品迅速投入到用液氮預冷到一150℃的氟利昂12或氟利昂22冷凍劑中，使樣品中的水分在片刻間凍結。 升華干燥 將已驟冷凍結的樣品移到冰凍干燥器內已預冷的樣臺上(保持一70C以下),抽真空(真空度為10～10-1Pa)，經幾小時或數天后，樣品即達到干燥； 裝臺鍍膜 先將冰凍干燥器的樣品臺加熱至室溫，然后將干燥器放氣，取出樣品迅速裝臺粘樣，送入鍍膜儀中鍍膜。 但是這種方法也有其不足之處，就是干燥時間太長，如單層細胞也要幾小時才能達到干燥，而幾毫米厚的組織塊可能要持續干燥一至數天，同時要判斷是否干燥也較為困難，冰凍過程中會形成冰晶，使細胞成份因受冰晶擠壓而產生移位和變形，造成人為的網狀結構。因此必須采取一些防止這一不良情況產生的措施，以使樣品的損傷減少到可以忽略的程度。 為了防止冰晶的形成，可采用以下辦法：①用驟冷劑提高冰凍速度。常用的驟冷劑有氟利昂12和氟利昂22；此外，液態一固態氮的半凝固狀混合物的溫度可低至-210℃，因此可作為驟冷劑；②用冷凍保護劑如二甲基亞砜、甘油、明膠或氯仿處理樣品，能抑制水分子集合成冰晶和限制冰晶的大小，以保護樣品免受冰晶的損傷，尤其以氯仿處理的效果為好，因為氯仿易于揮發，不留在樣品表面而影響觀察。此外，透射電鏡冰凍制樣技術中的冷凍方法，也適用于掃描電鏡。 樣品脫水后的冰凍干燥: 這種方法是用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發的有機溶劑如乙醚、氯仿、氟利昂113等中，然后連同這些溶劑一起冰凍并在真空中升華(直接用于脫水的乙醇作為冰凍干燥劑也有效)而達到樣品干燥的；這種方法相對于前一種方法有下列優點；即有機溶劑在冰凍時形成非晶體固態，不像水那樣結冰時膨脹，因此不會產生冰晶對樣品的損傷。有機溶劑能以比水快得多的速度從固態中升華，因此，干燥時間比上一方法短得多，不需要專用的冰凍干燥裝置，只用普通的真空干燥器加一塊金屬塊作樣品臺即可。但此法也有不足之處，就是有機溶劑對樣品成份有抽提作用，易造成部分內含物丟失。 此法的操作程序與前法基本相同，只是無需用冷凍保護劑處理而已。現將幾種方法介紹如下： 氟利昂TF冷凍干燥法： 固定脫水按常規方法進行。、 置換： 按圖中所示的比例配好氟利昂TF和酒精混合液，并通過這些混合液將樣品逐步引入100％氟利昂TF。 冷凍 把樣品浸入液氮中冷凍。 干燥 將樣品放在預先冷卻的鋁座上，再移入真空噴鍍儀中抽真空(約1Pa)，經0～20min后即完全干燥。90min后鋁座變為室溫，即取出樣品、裝臺、鍍膜觀察。 乙腈(acetonitrile)真空干燥法： 這是一種利用乙腈在急速蒸發時會冷卻固化這一性質，將樣品干燥的很獨特的方法。其操作步驟如下： 固定、水洗按常規方法進行。 脫水 使用上升的系列乙腈(50％～100％)脫水各20min。 滲透 在容量約Iml的鋁制容器中裝滿乙腈，并投入樣品。 升華 把容器放入真空噴鍍儀中抽真空，此時由于乙腈急速蒸發而使容器急劇冷卻，其中乙腈也變成冰狀固體。然后繼續抽真空，使乙腈升華， 約經30min，樣品即達干燥。 待容器回升到室溫后，即可取出樣品裝臺鍍膜進行觀察。 據田中敬一報道此法干燥的效果與臨界點干燥沒有什么不同。 茨烯干燥法 莰烯是一種樟腦類無色結晶體，能溶于醚、環乙烷、環己烯和氯仿中，室溫下呈固體狀，能在較低的溫度下升華，從固態直接變成氣態，表面張力小，故經它干燥的樣品較松軟，變形小，操作也較簡便。 莰烯干燥法是由Warrens．Buk于1971年提出的，其操作步驟如下： 取新鮮材料迅速投入0．1mol/L磷酸緩沖液中漂洗，然后投入5％的戊二醛(用磷酸緩沖液配制的pH7.4)中固定1h。 轉至加有5.4％蔗糖的0．1mol/L磷酸緩沖液中，在冷凍溫度下過夜。 用l％的四氧化鋨(磷酸緩沖液配制)溶液中固定2h。 用磷酸緩沖液或雙蒸水漂洗2～3次，每次、15min。 用30％，50％，70％，90％，95％和100％丙酮脫水，每級15min。 用100％的苯脫酯。 在1：1苯與環氧丙烷中浸泡15min，再轉至純環氧丙烷中，在45℃下經20min后，轉入預先在水浴箱中加溫成液體的莰烯中浸透，取出樣品裝臺。 放入真空干燥器中，在室溫下抽真空1h左右，使莰烯直接從固體中升華，然后鍍膜。
